Plasmide CRISPR d'Activation (h) α-actinin-4: sc-400548-ACT

ACTN4 code l’α-actinine-4, une protéine de liaison à l’actine sensible au calcium qui réticule l’actine filamentaire et ancre les réseaux du cytosquelette aux complexes d’adhésion. Elle se localise aux fibres de stress, aux adhésions focales et à des structures dynamiques riches en actine afin de réguler la forme cellulaire, les forces de traction et des processus dépendants du cytosquelette, notamment la migration et la cytocinèse. Par ses rôles dans le remodelage de l’actine et la signalisation des adhésions, l’α-actinine-4 influence des voies contrôlant la mécanotransduction et la motilité cellulaire. Une expression ou une fonction dérégulée d’ACTN4 a été associée à une invasivité cellulaire altérée et à un dysfonctionnement des podocytes rénaux, ce qui souligne sa pertinence pour l’étude des mécanismes de maladies liées au cytosquelette.

α-actinin-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACTN4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

α-actinin-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACTN4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACTN4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de α-actinin-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACTN4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de α-actinin-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie α-actinin-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de ACTN4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.