Plásmido CRISPR de Activación (h) Wip1: sc-400980-ACT

PPM1D codifica Wip1 (PPM1D), una fosfatasa de serina/treonina dependiente de Mg2+/Mn2+ inducida por p53 que actúa como un regulador clave de retroalimentación negativa de la respuesta al daño del ADN. Wip1 desfosforila múltiples proteínas de control del ciclo celular y de señalización de estrés, incluidas p53, componentes de la vía ATM/ATR y nodos de señalización de p38 MAPK, moldeando así la recuperación de los puntos de control del ciclo celular, la estabilidad genómica y los umbrales de apoptosis. Mediante la modulación de estas vías, Wip1 influye en las respuestas al estrés genotóxico y al estrés de replicación, y se han descrito alteraciones en la actividad y en el número de copias de PPM1D en diversos contextos tumorales. La perturbación experimental de Wip1 se utiliza ampliamente para analizar la dinámica de los puntos de control, la señalización adaptativa al estrés y el crosstalk entre vías que controlan la proliferación y la senescencia.

Wip1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PPM1D sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Wip1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PPM1D en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PPM1D, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Wip1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PPM1D y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Wip1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Wip1 en células tumorales con expresión de PPM1D silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.