Plásmido CRISPR de Activación (h) Wee 1: sc-400701-ACT

WEE1 codifica la tirosina cinasa nuclear Wee1, un regulador central del punto de control de daño del ADN en G2/M que restringe la actividad de CDK1–ciclina B mediante fosforilación inhibitoria. Al integrar señales de las vías ATR/CHK1 y del estrés replicativo, Wee1 coordina la progresión del ciclo celular con la finalización de la replicación del ADN y la reparación, favoreciendo la estabilidad del genoma durante la fase S y la mitosis. La expresión o actividad desregulada de WEE1 se asocia con frecuencia con un control alterado de los puntos de control, tolerancia al estrés replicativo e inestabilidad cromosómica en la biología del cáncer, y también se estudia en contextos de respuestas al estrés genotóxico. Como resultado, WEE1 se investiga comúnmente en mecanismos de control del ciclo celular, señalización de daño del ADN y estudios de interacciones sintéticas que involucran el estado de p53 y otros componentes de los puntos de control.

Wee 1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de WEE1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Wee 1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus WEE1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional WEE1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Wee 1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo WEE1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Wee 1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Wee 1 en células tumorales con expresión de WEE1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.