Plásmido Doble Nickase (h) Von Hippel Lindau/VHL: sc-400528-NIC

VHL codifica el supresor tumoral von Hippel–Lindau, el componente de reconocimiento de sustratos de un complejo de ligasa E3 de ubiquitina Cullin 2–RING que, en normoxia, dirige a HIF-α hidroxilado a la ubiquitinación y a su degradación por el proteasoma. Al acoplar la detección de oxígeno al control transcripcional de programas de angiogénesis, metabolismo, eritropoyesis y matriz extracelular, VHL ayuda a mantener la homeostasis celular y respuestas hipóxicas adecuadas. La pérdida o disfunción de VHL altera la señalización de HIF y reconfigura vías vinculadas a la biología vascular, el metabolismo mitocondrial y la proteostasis. La alteración de VHL está estrechamente asociada con la enfermedad hereditaria de VHL y se estudia con frecuencia en modelos de carcinoma de células renales para investigar la biología tumoral impulsada por la hipoxia y la adaptación al microambiente.

Von Hippel Lindau/VHL El plásmido de doble nicasa (h) consiste en un par de plásmidos emparejados diseñados para la edición de alta especificidad del locus VHL en líneas celulares human. Cada plásmido expresa una nicasa Cas9 D10A y un ARN guía específico (sgRNA) dirigido a cadenas de ADN opuestas dentro de VHL. Cuando se dirigen a sitios adyacentes en cadenas de ADN opuestas, las dos nicasas generan cortes en cadena simple desplazados que, juntos, producen una rotura de doble cadena escalonada, lo que requiere una actividad coordinada sobre el objetivo por parte de ambas guías. La rotura de ADN resultante se resuelve mediante vías de reparación celular endógenas, más comúnmente a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ), lo que da lugar a inserciones o deleciones que alteran la función de VHL. Al requerir la participación de dos ARN guía en el locus diana, el enfoque de doble corte mejora la especificidad de la edición y proporciona una estrategia CRISPR complementaria para aplicaciones en las que se desea un control adicional sobre la precisión de la orientación.

Para facilitar la identificación eficiente de las células editadas, un plásmido codifica GFP para la visualización fluorescente de las poblaciones transfectadas, mientras que el plásmido complementario lleva un gen de resistencia a la puromicina para la selección con antibióticos. En conjunto, estas características facilitan el enriquecimiento eficiente de las poblaciones cotransfectadas y simplifican la validación de los clones con VHL alterado.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.