vinculin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400227-ACT

O VCL humano codifica a vinculina, um adaptador mecanossensível de ligação à actina, enriquecido em adesões focais e junções aderentes, onde acopla os complexos de integrinas e caderinas ao citoesqueleto de actina. A vinculina regula a dinâmica de adesão célula–MEC e célula–célula, a transmissão de forças e a remodelação do citoesqueleto por vias que envolvem talina, paxilina, sinalização FAK/Src e GTPases da família Rho. Ao ajustar a renovação das adesões e as forças de tração, o VCL influencia a migração, a polaridade e a morfogénese dos tecidos, e a sua desregulação é estudada em contextos de invasividade alterada e potencial metastático. A mecanotransdução dependente de VCL também é relevante em modelos de adesão de cardiomiócitos e acoplamento contrátil, nos quais alterações na integridade das junções podem afetar as respostas ao stress.

vinculin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VCL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

vinculin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VCL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VCL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de vinculin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VCL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de vinculin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via vinculin em células tumorais com expressão de VCL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.