Plásmido CRISPR de Activación (h) utrophin: sc-400522-ACT

El UTRN humano codifica la utrofina, una proteína citoesquelética relacionada con la distrofina que conecta la red de actina con el complejo distrofina–glicoproteína en el sarcolema y en dominios especializados de la membrana, como la unión neuromuscular. La utrofina contribuye a la estabilidad de la membrana, a la mecanotransducción y a la organización de la señalización asociada a la adhesión al coordinar interacciones entre componentes de la matriz extracelular, receptores transmembrana y andamiajes intracelulares. Su expresión está regulada durante el desarrollo y a menudo se encuentra enriquecida en regiones sinápticas, lo que respalda estudios sobre la arquitectura de las fibras musculares y el mantenimiento de las sinapsis. Las alteraciones en la abundancia o la localización de la utrofina se analizan con frecuencia en el contexto de la biología de las distrofias musculares y de las vías compensatorias que influyen en la integridad muscular.

utrophin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UTRN sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

utrophin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UTRN en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UTRN, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de utrophin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UTRN y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de utrophin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía utrophin en células tumorales con expresión de UTRN silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.