Plásmido CRISPR de Activación (h) Usherin: sc-409699-ACT

USH2A codifica usherina, una gran proteína transmembrana asociada a la matriz extracelular, enriquecida en epitelios sensoriales, donde sustenta la arquitectura y la mecanotransducción de los fotorreceptores y de las células ciliadas del oído interno. La usherina participa en la organización de las redes de proteínas de Usher y contribuye a interacciones célula–célula y célula–matriz que estabilizan los haces de estereocilios y el complejo de membrana periciliar. A través de estas funciones, USH2A se vincula con procesos que gobiernan la ciliogénesis, la adhesión y el tráfico intracelular en células polarizadas. La alteración genética de USH2A se asocia fuertemente con la degeneración retiniana hereditaria y con fenotipos sindrómicos de audición/visión, lo que la convierte en un locus clave para estudiar el mantenimiento de las células sensoriales y los mecanismos de degeneración.

Usherin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de USH2A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Usherin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus USH2A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional USH2A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Usherin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo USH2A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Usherin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Usherin en células tumorales con expresión de USH2A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.