Plasmide CRISPR d'Activation (h) UBPY: sc-403737-ACT

L’USP8 humain code l’enzyme déubiquitinante UBPY, une protéase spécifique de l’ubiquitine qui modifie les chaînes d’ubiquitine présentes sur des composants du trafic endocytaire et sur des substrats de récepteurs afin de contrôler la stabilité et le tri des protéines. UBPY agit dans le système endosomal en coordination avec la machinerie associée aux ESCRT, en régulant la déubiquitination des cargaisons, le recyclage des récepteurs par rapport à leur dégradation lysosomale, ainsi que l’amplitude des signaux en aval. Par ces activités, USP8 influence des voies liées à la signalisation des récepteurs aux facteurs de croissance, au transport vésiculaire et à la protéostase, souvent impliquées dans une signalisation cellulaire dérégulée et une fonction endolysosomale altérée. Des études génétiques et fonctionnelles ont associé des perturbations d’USP8 à des phénotypes pertinents pour la maladie, impliquant un renouvellement anormal des récepteurs et un remaniement des réseaux de signalisation, ce qui étaye son intérêt en tant que nœud mécanistique pour la recherche sur l’homéostasie cellulaire.

UBPY Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de USP8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UBPY Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus USP8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription USP8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UBPY. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus USP8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UBPY au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UBPY dans les cellules tumorales présentant une expression de USP8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.