Plásmido CRISPR de Activación (h) Tyrosine Hydroxylase: sc-400273-ACT

TH codifica la tirosina hidroxilasa, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de catecolaminas que convierte la L-tirosina en L-DOPA, controlando así la producción posterior de dopamina, noradrenalina y adrenalina. Su actividad se integra con el metabolismo del cofactor tetrahidrobiopterina (BH4) y está regulada por vías de señalización dependientes de fosforilación que ajustan la salida de neurotransmisores en respuesta a la actividad neuronal y a señales de estrés. La expresión de TH y su control enzimático son centrales para la identidad de las neuronas dopaminérgicas y noradrenérgicas, la transmisión sináptica y la función neuroendocrina. La desregulación de TH y de la homeostasis de las catecolaminas está implicada en la biología de enfermedades neurológicas y neuropsiquiátricas, incluidos trastornos que afectan los circuitos dopaminérgicos y la regulación autonómica.

Tyrosine Hydroxylase El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TH sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Tyrosine Hydroxylase El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TH en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TH, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Tyrosine Hydroxylase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TH y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Tyrosine Hydroxylase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Tyrosine Hydroxylase en células tumorales con expresión de TH silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.