Tyro3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423567-ACT

Tyro3 kodiert eine Rezeptor-Tyrosinkinase der TAM-Familie, die als Antwort auf Liganden wie GAS6 und Protein S das Zellüberleben, die Proliferation und den Umbau des Zytoskeletts reguliert. In Mausgeweben ist die TYRO3-Signalübertragung mit den PI3K–AKT-, MAPK/ERK- und JAK/STAT-Signalwegen verknüpft und prägt Prozesse wie die phagozytische Beseitigung apoptotischer Zellen sowie die Modulation des angeborenen Immuntonus. Über Crosstalk mit AXL und MERTK trägt Tyro3 zur homöostatischen Kontrolle inflammatorischer Signale bei und kann Zellzustandsübergänge in unterschiedlichen Mikroumgebungen beeinflussen. Eine fehlregulierte Aktivität von TAM-Rezeptoren wurde mit aberranter Immunregulation und onkogenen Signalkontexten in Verbindung gebracht, wodurch Tyro3 einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien in Modellen der Neurobiologie, Immunologie und Krebsbiologie darstellt.

Tyro3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tyro3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Tyro3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tyro3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tyro3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Tyro3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tyro3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Tyro3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Tyro3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tyro3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.