TTYH1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408039-ACT

TTYH1 (membro 1 della famiglia Tweety) codifica una proteina di membrana multipasso arricchita nel sistema nervoso ed è implicata nella regolazione dell’omeostasi ionica, dell’eccitabilità di membrana e della dinamica del volume cellulare. TTYH1 è stata collegata a processi quali la segnalazione attivata dal calcio, risposte associate alla conduttanza del cloruro e il rimodellamento del citoscheletro che influenzano la migrazione e la crescita dei neuriti. In modelli cellulari, un’alterata espressione di TTYH1 può modificare la proliferazione e il comportamento invasivo, in linea con associazioni riportate con la biologia dello sviluppo neurocognitivo e con programmi trascrizionali legati ai tumori cerebrali. Queste caratteristiche rendono TTYH1 un nodo rilevante per lo studio della segnalazione associata alla membrana e delle vie di adattamento al microambiente nelle cellule umane.

TTYH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TTYH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TTYH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TTYH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TTYH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TTYH1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TTYH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TTYH1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TTYH1 nelle cellule tumorali con espressione di TTYH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.