Plásmido CRISPR de Activación (h) TRPV5: sc-403668-ACT

TRPV5 codifica un canal catiónico de la familia TRP altamente selectivo para el calcio y constitutivamente activo, localizado predominantemente en la membrana apical de las células epiteliales, donde media la entrada transcelular de Ca2+. La actividad del canal se coordina con las vías de homeostasis del calcio, incluido el amortiguamiento por calbindina y la extrusión basolateral mediante el intercambio Na+/Ca2+ y las Ca2+-ATPasas, y está modulada por factores como el Ca2+ intracelular, el pH y la señalización calciotrópica. La función de TRPV5 está estrechamente vinculada a los programas de transporte iónico epitelial y a la fisiología de la reabsorción de calcio, lo que lo convierte en un nodo relevante para el estudio del metabolismo mineral y del transporte a través de la barrera epitelial. La expresión o actividad desregulada de TRPV5 se ha asociado con fenotipos de manejo alterado del calcio y se ha investigado en contextos de trastornos del equilibrio renal y sistémico del calcio.

TRPV5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TRPV5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TRPV5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TRPV5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TRPV5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TRPV5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TRPV5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TRPV5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TRPV5 en células tumorales con expresión de TRPV5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.