TRAP220 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400855-ACT

MED1 (TRAP220) è una subunità centrale del complesso Mediator che collega i fattori di trascrizione specifici di sequenza alla RNA polimerasi II, coordinando l’inizio della trascrizione e la trascrizione dipendente dagli enhancer. In quanto coattivatore dei recettori nucleari, TRAP220 integra i segnali provenienti dalle vie ormonali e metaboliche per regolare programmi che controllano proliferazione, differenziamento e risposte cellulari allo stress. Il controllo trascrizionale dipendente da MED1 si interseca con il rimodellamento della cromatina e con la regolazione epigenetica, influenzando la specificazione di linea cellulare e stati trascrizionali oncogeni dipendenti dal contesto. Un’attività di MED1 deregolata e un’alterata segnalazione del Mediator sono state associate a tumori ormono-responsivi e ad altri disturbi che coinvolgono squilibri trascrizionali e metabolici, rendendolo un utile bersaglio per studi meccanicistici della regolazione della trascrizione.

TRAP220 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MED1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRAP220 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MED1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MED1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRAP220. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MED1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRAP220 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRAP220 nelle cellule tumorali con espressione di MED1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.