Plasmide CRISPR d'Activation (h) TNAP: sc-400784-ACT

ALPL code la phosphatase alcaline non spécifique des tissus (TNAP), une ectoenzyme ancrée par glycosylphosphatidylinositol (GPI) qui hydrolyse les monoesters de phosphate extracellulaires afin de réguler l’équilibre entre phosphate inorganique et pyrophosphate. En contrôlant la disponibilité du pyrophosphate et en générant du phosphate nécessaire à la formation d’hydroxyapatite, la TNAP est un régulateur central des programmes de minéralisation et de la différenciation des ostéoblastes, et elle interagit avec la signalisation purinergique via le métabolisme de nucléotides tels que l’ATP. L’activité de la TNAP influence également la composition de la matrice extracellulaire et la propension à la calcification dans les tissus osseux et vasculaires. Un dysfonctionnement d’ALPL/TNAP est associé à des dépôts minéraux anormaux et à des phénotypes squelettiques, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la biologie osseuse, des voies de calcification et de l’homéostasie du phosphate.

TNAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ALPL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TNAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ALPL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ALPL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TNAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ALPL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TNAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TNAP dans les cellules tumorales présentant une expression de ALPL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.