TMEFF1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404818-ACT

Humanes TMEFF1 (transmembranes Protein mit EGF-ähnlicher sowie zwei follistatinähnlichen Domänen 1) kodiert ein Single-Pass-Membranprotein, das an extrazellulären Ligandeninteraktionen und der Modulation von Wachstumsfaktor-Signalwegen beteiligt ist. Berichtet wird über Funktionen von TMEFF1 in der Regulation von Zellproliferation und Differenzierungsprogrammen, mit kontextabhängigen Effekten auf Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwege wie EGFR/ERK und PI3K–AKT. Die TMEFF1-Expression ist bei mehreren Tumorarten häufig dysreguliert und wurde mit veränderten epithelialen Zellzuständen, Invasivität und Signalgebung im Mikroumfeld in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen TMEFF1 zu einem nützlichen Ziel, um die Signalintegration an der Plasmamembran und die transkriptionellen Konsequenzen von Störungen in Wachstumsfaktor-Signalwegen zu untersuchen.

TMEFF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMEFF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TMEFF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMEFF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMEFF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TMEFF1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMEFF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TMEFF1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TMEFF1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMEFF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.