TMED2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402765-ACT

TMED2 (transmembranes p24-Transportprotein 2) ist ein Typ-I-Membranprotein aus der p24-Familie der Frachtrezeptoren, das zwischen endoplasmatischem Retikulum und Golgi-Apparat zirkuliert und so Vesikelknospung, Frachtauswahl und die Homöostase des sekretorischen Wegs reguliert. Durch seine Beteiligung am COPI/COPII-abhängigen Transport und an der Qualitätskontrolle der frühen Sekretion beeinflusst TMED2 die Reifung und den Transport zahlreicher Membran- und sekretierter Proteine zur Zelloberfläche. Veränderte sekretorische Transportprozesse und eine gestörte ER–Golgi-Transportdynamik werden häufig mit Proteostase-Stressantworten und Veränderungen der zellulären Signalübertragung in Verbindung gebracht. Eine Fehlregulation von Mitgliedern der p24-Familie, einschließlich TMED2, wurde in der Literatur mit Tumorbiologie und weiteren Zuständen assoziiert, bei denen abnorme Sekretion, Rezeptortransport und zelluläre Stresswege zu krankheitsrelevanten Phänotypen beitragen.

TMED2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMED2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TMED2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMED2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMED2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TMED2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMED2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TMED2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TMED2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMED2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.