Plásmido CRISPR de Activación (h) TID-1_L/S: sc-404796-ACT

DNAJA3 codifica la cochaperona mitocondrial DnaJ/Hsp40 TID-1, que se expresa como isoformas larga y corta (TID-1L/S) y coordina el plegamiento, la importación y el control de calidad de proteínas dependientes de Hsp70 dentro de la mitocondria. Mediante la regulación de la proteostasis y de las respuestas mitocondriales al estrés, TID-1L/S influye en la función de la cadena respiratoria, el manejo de especies reactivas de oxígeno y la dinámica mitocondrial que determina la supervivencia celular y la señalización metabólica. DNAJA3 se ha vinculado a vías que gobiernan la apoptosis y la adaptación celular al estrés, lo que lo sitúa como un nodo útil para estudiar la disfunción mitocondrial en biología del cáncer y fenotipos asociados a la neurodegeneración. La alteración de la actividad de TID-1L/S puede modificar la homeostasis mitocondrial y programas de señalización downstream relevantes para el estrés proteotóxico y el metabolismo energético.

TID-1L/S El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DNAJA3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TID-1L/S El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DNAJA3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DNAJA3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TID-1L/S. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DNAJA3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TID-1L/S en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TID-1L/S en células tumorales con expresión de DNAJA3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.