Thrombospondin 5 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419759-ACT

Comp kodiert Thrombospondin 5 (Cartilage Oligomeric Matrix Protein, COMP), ein sezerniertes extrazelluläres Matrix-Glykoprotein, das in Knorpel und Sehnen angereichert ist und den Aufbau der Matrix sowie die mechanische Integrität des Gewebes unterstützt. Thrombospondin 5 ist an der Kollagenfibrillogenese und der Organisation der extrazellulären Matrix beteiligt und beeinflusst Zell‑Matrix‑Interaktionen, die die Chondrozytendifferenzierung und die Skelettentwicklung prägen. Eine veränderte COMP-Expression oder Fehlfaltung steht mit Dysfunktionen der Wachstumsfuge, Stressantworten des endoplasmatischen Retikulums und degenerationsassoziiertem Umbau von Knorpel in Verbindung. In Mausmodellen wird Comp häufig genutzt, um die Homöostase der extrazellulären Matrix, Mechanobiologie sowie Signalwege zu untersuchen, die zur Knorpelpathologie und zu Bindegewebsphänotypen beitragen.

Thrombospondin 5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Comp-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Thrombospondin 5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Comp-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Comp-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Thrombospondin 5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Comp-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Thrombospondin 5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Thrombospondin 5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Comp-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.