Thrombospondin 3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405109-ACT

THBS3 codifica la trombospondina 3, una glicoproteina secreta della matrice extracellulare che modula le interazioni cellula–matrice e la segnalazione intercellulare nei tessuti connettivi. I membri della famiglia delle trombospondine influenzano l’assemblaggio della matrice, la fibrillogenesi del collagene e l’organizzazione dei proteoglicani, contribuendo così a definire i programmi di adesione, migrazione e rimodellamento tissutale. L’attività di THBS3 viene comunemente studiata nel contesto dell’omeostasi della matrice extracellulare e delle risposte allo stress che influenzano lo sviluppo muscoloscheletrico e la biologia della cartilagine. Una segnalazione matricellulare disregolata e una composizione alterata della ECM sono caratteristiche ricorrenti di fenotipi degenerativi e fibrotici, rendendo THBS3 un nodo utile per studi meccanicistici dei processi patologici guidati dalla matrice.

Thrombospondin 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di THBS3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Thrombospondin 3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus THBS3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione THBS3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Thrombospondin 3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus THBS3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Thrombospondin 3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Thrombospondin 3 nelle cellule tumorali con espressione di THBS3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.