TFEB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401388-ACT

Il TFEB umano (transcription factor EB) è un regolatore maestro della biogenesi lisosomiale e dell’autofagia, coordinando l’espressione dei geni della rete CLEAR che controllano la funzione endolisosomiale, il traffico di membrana e la clearance cellulare. L’attività di TFEB è strettamente legata al sensing dei nutrienti tramite la fosforilazione dipendente da mTORC1 e la traslocazione nucleare, integrando i segnali di stress metabolico con programmi catabolici. Una deregolazione della segnalazione di TFEB è stata associata a una proteostasi compromessa e a disfunzioni legate ai lisosomi osservate nella neurodegenerazione, nelle malattie da accumulo lisosomiale e nella biologia dei tumori. In quanto nodo trascrizionale, TFEB rappresenta un punto di accesso gestibile per studiare il flusso autofagico, il rimodellamento dei lisosomi e le reti trascrizionali di adattamento allo stress.

TFEB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TFEB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TFEB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TFEB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TFEB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TFEB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TFEB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TFEB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TFEB nelle cellule tumorali con espressione di TFEB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.