TERT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400316-ACT

Humanes TERT kodiert die Telomerase-Reverse-Transkriptase, die katalytische Untereinheit der Telomerase, welche telomerische Wiederholungen verlängert, um die Integrität der Chromosomenenden zu erhalten und eine langfristige Replikationsfähigkeit zu ermöglichen. Die TERT-Aktivität ist mit dem Netzwerk zur Telomererhaltung koordiniert, einschließlich der Regulation durch den Shelterin-Komplex, der Antworten auf Replikationsstress sowie DNA-Schadenssignalwege wie ATM/ATR, die aktiviert werden, wenn Telomere dysfunktional werden. Eine fehlregulierte Telomerase-Expression trägt zu veränderter zellulärer Seneszenz, Genominstabilität und Immortalisierungsphänotypen bei, während vererbte oder erworbene Störungen der Telomerbiologie mit vielfältigen Erkrankungen in Verbindung stehen, die durch vorzeitige Telomerverkürzung gekennzeichnet sind. Als zentraler Knotenpunkt der Telomerhomöostase wird TERT breit in Modellen der Stammzell-Selbsterneuerung, des replikativen Alterns und der telomergetriebenen Genomerhaltung untersucht.

TERT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TERT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TERT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TERT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TERT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TERT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TERT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TERT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TERT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TERT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.