TDP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405057-ACT

Die Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase 1 (TDP1) ist ein DNA-Reparaturenzyme, das blockierte kovalente Topoisomerase‑I–DNA‑Komplexe auflöst, indem es 3′‑Phosphotyrosyl-Bindungen hydrolysiert und dadurch wieder ligierbare DNA-Enden im Rahmen der Einzelstrangbruchreparatur herstellt. Diese Aktivität unterstützt die Genomstabilität unter Transkriptions- und Replikationsstress und ist mit Signal- und Reparaturwegen verknüpft, die von PARP1, XRCC1 und DNA-Ligase III koordiniert werden, um oxidative und abortive Ligationzwischenprodukte zu verarbeiten. Eine Beeinträchtigung der TDP1-Funktion stört die Reparatur topoisomeraseinduzierter Läsionen und wurde mit Neurodegeneration sowie erhöhter Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Agenzien in Verbindung gebracht, was ihre Relevanz für Studien zur neuronalen Erhaltung und zu genotoxischen Stressantworten unterstreicht. In der Krebsbiologie und Chromosomenbiologie wird TDP1 häufig im Hinblick auf ihre Rolle bei der Toleranz gegenüber DNA-Schäden, der Integrität von Replikationsgabeln und der transkriptionsassoziierten Reparatur von DNA-Brüchen untersucht.

TDP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TDP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TDP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TDP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TDP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TDP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TDP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TDP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TDP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TDP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.