TDP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405057-ACT

A fosfodiesterase tirosil-DNA 1 (TDP1) é uma enzima de reparo do DNA que resolve complexos covalentes topoisomerase I–DNA bloqueados ao hidrolisar ligações 3′-fosfotirosil, restaurando extremidades de DNA passíveis de ligação durante o reparo de quebras de fita simples. Essa atividade sustenta a estabilidade do genoma sob estresse de transcrição e replicação e interage com vias coordenadas por PARP1, XRCC1 e DNA ligase III para processar intermediários oxidativos e de ligação abortiva. A perturbação da função de TDP1 compromete o reparo de lesões induzidas por topoisomerase e tem sido associada à neurodegeneração e a maior sensibilidade a agentes que danificam o DNA, ressaltando sua relevância para estudos de manutenção neuronal e de respostas ao estresse genotóxico. Em pesquisas de biologia do câncer e biologia cromossômica, a TDP1 é frequentemente investigada por seu papel na tolerância a danos no DNA, na integridade da forquilha de replicação e no reparo de quebras de DNA associadas à transcrição.

TDP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TDP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TDP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TDP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TDP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TDP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TDP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TDP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TDP1 em células tumorais com expressão de TDP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.