TDO2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402482-ACT

Humanes TDO2 (Tryptophan-2,3-Dioxygenase) ist ein hämabhängiges Enzym, das den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Tryptophanabbaus über den Kynureninweg katalysiert und dabei L‑Tryptophan zu N‑Formylkynurenin umsetzt. Durch die Regulation der intra- und extrazellulären Verfügbarkeit von Tryptophan sowie der Kynureninproduktion beeinflusst TDO2 das Redoxgleichgewicht, die metabolische Anpassung und die Bereitstellung von Liganden für die Signalübertragung über den Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AHR). Die TDO2-Aktivität verknüpft den Aminosäurestoffwechsel mit Immun- und Stressantwortprogrammen über nachgeschaltete Kynureninmetaboliten, die Vorstufen der NAD+-Biosynthese und die zelluläre Signalübertragung modulieren können. Ein dysregulierter Tryptophan–Kynurenin-Fluss unter Beteiligung von TDO2 wurde mit entzündlichen Zuständen, neurobiologischen Prozessen und tumorassoziiertem metabolischem Remodeling in Verbindung gebracht, was seinen Einsatz als mechanistischen Knotenpunkt in Pathway-Studien unterstützt.

TDO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TDO2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TDO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TDO2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TDO2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TDO2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TDO2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TDO2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TDO2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TDO2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.