TDO2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402482-ACT

La TDO2 umana (triptofano 2,3-diossigenasi) è un enzima eme-dipendente che catalizza il primo passaggio, e quello limitante la velocità, del catabolismo del triptofano lungo la via della chinurenina, convertendo la L-triptofano in N-formilchinurenina. Regolando la disponibilità intra- ed extracellulare di triptofano e la produzione di chinurenina, TDO2 influenza l’equilibrio redox, l’adattamento metabolico e la disponibilità di ligandi per la segnalazione del recettore degli idrocarburi arilici (AHR). L’attività di TDO2 collega il metabolismo degli amminoacidi a programmi immunitari e di risposta allo stress attraverso i metaboliti a valle della chinurenina, che possono modulare i precursori della biosintesi del NAD+ e la segnalazione cellulare. Un flusso triptofano–chinurenina deregolato che coinvolge TDO2 è stato associato a stati infiammatori, processi legati alla neurobiologia e al rimodellamento metabolico associato ai tumori, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico negli studi di pathway.

TDO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TDO2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TDO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TDO2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TDO2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TDO2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TDO2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TDO2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TDO2 nelle cellule tumorali con espressione di TDO2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.