TCP-1 η Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403833-ACT

O CCT7 codifica a subunidade TCP-1 η (CCTη) do complexo chaperonina citosólica contendo TCP-1 (CCT/TRiC), uma máquina de dobramento dependente de ATP necessária para a maturação de proteínas estruturalmente complexas, como actina e tubulina. Ao sustentar a montagem do citoesqueleto, a proteostase e o controle de qualidade, o CCT/TRiC influencia a progressão do ciclo celular, o tráfego intracelular e as respostas ao estresse, incluindo a comunicação cruzada com as vias ubiquitina–proteassoma. A atividade de chaperoninas desregulada tem sido associada a alterações em programas de homeostase proteica observados em contextos de doenças proliferativas e neurodegenerativas, tornando o CCT7 um alvo útil para investigar fenótipos dependentes de dobramento. Em células humanas, a perturbação da expressão de CCT7 pode revelar como a capacidade de chaperonas limita a dinâmica do citoesqueleto e redes de sinalização que dependem de proteínas cliente corretamente dobradas.

TCP-1 η O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCT7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TCP-1 η O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCT7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCT7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TCP-1 η. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCT7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TCP-1 η no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TCP-1 η em células tumorais com expressão de CCT7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.