Plásmido CRISPR de Activación (h) TCP-1 ε: sc-402993-ACT

CCT5 codifica la subunidad ε humana de TCP-1 del complejo chaperonina TRiC/CCT, una maquinaria de plegamiento dependiente de ATP que favorece la maduración de proteínas nacientes y de proteínas desnaturalizadas por estrés en el citosol. TRiC contribuye a la proteostasis al ayudar al plegamiento de sustratos clave, como la actina y la tubulina, influyendo así en la organización del citoesqueleto, el tráfico vesicular y la progresión del ciclo celular. La alteración de la capacidad de la chaperonina puede modificar la estabilidad del proteoma y las respuestas al estrés, vinculando la función de CCT5/TCP-1 ε con vías que determinan la aptitud celular en condiciones de estrés proteotóxico. La actividad de chaperonas desregulada y las redes de plegamiento deterioradas se investigan con frecuencia en el contexto de la neurodegeneración y la biología del cáncer como factores que contribuyen a la agregación de proteínas, el desequilibrio de la señalización y programas de proliferación alterados.

TCP-1 ε El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CCT5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TCP-1 ε El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CCT5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CCT5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TCP-1 ε. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CCT5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TCP-1 ε en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TCP-1 ε en células tumorales con expresión de CCT5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.