Plásmido CRISPR de Activación (h) TBC1D7: sc-403595-ACT

TBC1D7 codifica una pequeña proteína que contiene un dominio TBC y que funciona como componente central del complejo TSC1–TSC2–TBC1D7, un regulador negativo clave de la señalización de mTORC1. Al estabilizar el complejo TSC y apoyar la actividad GAP sobre RHEB, TBC1D7 ayuda a acoplar las señales de factores de crecimiento y nutrientes al control de la síntesis de proteínas, la autofagia y el metabolismo celular. Las alteraciones en la dosis o la función de TBC1D7 se han relacionado con una actividad desregulada de la vía de mTOR y con fenotipos compatibles con un deterioro de la red supresora de tumores. Como resultado, TBC1D7 se estudia ampliamente en contextos como el control del crecimiento celular, las respuestas al estrés y el “crosstalk” entre vías que influye en la proliferación y la diferenciación.

TBC1D7 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TBC1D7 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TBC1D7 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TBC1D7 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TBC1D7, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TBC1D7. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TBC1D7 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TBC1D7 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TBC1D7 en células tumorales con expresión de TBC1D7 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.