Synaptotagmin VII CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404291-ACT

SYT7 kodiert Synaptotagmin VII, ein Ca2+-sensitives Membranprotein, das die Ca2+-abhängige Exozytose und die Membranreparatur über SNARE-vermittelte Vesikelfusion reguliert. Es ist an der Exozytose sekretorischer Lysosomen, an der Wiederabdichtung der Plasmamembran nach Verletzungen sowie an der regulierten Freisetzung von Frachtproteinen in Immun- und neuronähnlichen Zellen beteiligt und verknüpft damit Kalziumsignale mit dem vesikulären Transport. Die Aktivität von Synaptotagmin VII beeinflusst Prozesse wie die Dynamik der Neurotransmitterfreisetzung, die Zytokinsekretion und den endosomalen/lysosomalen Transport. Eine veränderte SYT7-Expression oder -Funktion wurde mit Phänotypen einer gestörten Sekretion und Membranhomöostase in Verbindung gebracht, die für Neurobiologie, Entzündungsprozesse und zelluläre Stressantworten relevant sind.

Synaptotagmin VII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SYT7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Synaptotagmin VII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SYT7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SYT7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Synaptotagmin VII-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SYT7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Synaptotagmin VII-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Synaptotagmin VII-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SYT7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.