Synaptotagmin IV CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403314-ACT

SYT4 kodiert Synaptotagmin IV, ein membranassoziiertes C2-Domänenprotein, das an sekretorischen Vesikeln lokalisiert und die Ca²⁺-abhängige Exozytose in Neuronen und anderen erregbaren Zellen moduliert. Im Unterschied zu kanonischen Synaptotagminen, die als schnelle Ca²⁺-Sensoren wirken, wird Synaptotagmin IV häufig mit einer aktivitätsabhängigen Feinabstimmung der Wahrscheinlichkeit der Vesikelfusion, synaptischer Plastizität sowie der regulierten Freisetzung von Neuropeptiden und Neurotransmittern in Verbindung gebracht. Die SYT4-Funktion überschneidet sich mit SNARE-vermittelter Membranfusion, Vesikeltransport und Signalwegen der Stimulus‑Sekretions‑Kopplung, die die Anpassung neuronaler Netzwerke beeinflussen. Eine veränderte Expression oder Regulation der Vesikelfreisetzungsmaschinerie, einschließlich SYT4, wurde mit neuroentwicklungsbedingten und neuropsychiatrischen Phänotypen assoziiert und wird im Kontext synaptischer Dysfunktion untersucht.

Synaptotagmin IV Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SYT4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Synaptotagmin IV Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SYT4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SYT4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Synaptotagmin IV-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SYT4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Synaptotagmin IV-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Synaptotagmin IV-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SYT4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.