Plásmido CRISPR de Activación (h) Squalene epoxidase: sc-402870-ACT

SQLE codifica la epoxidasa de escualeno, una monooxigenasa dependiente de flavina que cataliza la epoxidación del escualeno a 2,3-oxidoescualeno, un paso comprometido y determinante de la velocidad en la biosíntesis de esteroles. Esta enzima asociada al retículo endoplásmico (RE) ayuda a controlar los niveles de colesterol y otros esteroles, vinculando la actividad de SQLE con la composición de la membrana, la dinámica de las balsas lipídicas y la disponibilidad de precursores esteroidogénicos. SQLE está regulada por el estado lipídico celular e interactúa con programas metabólicos impulsados por SREBP que coordinan la homeostasis del colesterol y un metabolismo lipídico más amplio. La desregulación de la expresión de SQLE se ha asociado con alteraciones en el flujo de esteroles y con la reprogramación metabólica observada en múltiples contextos relevantes para enfermedades, incluidos estados proliferativos e inflamatorios.

Squalene epoxidase El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SQLE sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Squalene epoxidase El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SQLE en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SQLE, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Squalene epoxidase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SQLE y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Squalene epoxidase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Squalene epoxidase en células tumorales con expresión de SQLE silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.