Spastin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402225-ACT

Das humane **SPAST**-Gen kodiert **Spastin**, eine AAA-ATPase und mikrotubuli-sezierende Enzymaktivität, die das Mikrotubuli-Zytoskelett umgestaltet, indem sie Tubulin-Untereinheiten aus dem Mikrotubulusgitter herauslöst. Spastin unterstützt die Aufrechterhaltung von Axonen, den endosomalen und ER-Transport sowie Membranabschnürungsprozesse und ist dabei mit zytoskelettalen Dynamiken verknüpft, die das Neuritenauswachsen und den intrazellulären Transport formen. Über diese Funktionen beeinflusst **SPAST** Signalwege, die die Organellenverteilung und die neuronale Konnektivität in lang projizierenden Neuronen steuern. Eine Fehlregulation oder ein Verlust der Spastin-Aktivität ist eng mit der hereditären spastischen Paraplegie verbunden und wird häufig in Modellen der Axonopathie sowie von transportbezogenen Defekten im Kontext von Neurodegeneration untersucht.

Spastin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPAST-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Spastin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPAST-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPAST-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Spastin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPAST-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Spastin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Spastin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPAST-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.