Plasmide CRISPR d'Activation (m) SP-lyase: sc-422908-ACT

Le gène murin **Sgpl1** code la lyase du sphingosine-1-phosphate (S1P), une enzyme associée au réticulum endoplasmique qui dégrade irréversiblement le S1P afin de mettre fin à la signalisation au sein du réseau métabolique des sphingolipides. En contrôlant les niveaux intracellulaires et extracellulaires de S1P, la lyase du S1P influence la rhéostasie lipidique et les voies en aval qui régissent la survie cellulaire, les réponses au stress, la migration et le trafic des cellules immunitaires. Une activité altérée de **SGPL1** perturbe l’axe céramide–sphingosine–S1P et a été associée, dans des systèmes modèles, à des phénotypes inflammatoires, à une dysrégulation métabolique et à une physiopathologie neuro-rénale. Ce gène est donc largement utilisé pour étudier le flux des sphingolipides, la signalisation des barrières et/ou vasculaire, ainsi que les mécanismes d’homéostasie immunitaire.

SP-lyase Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Sgpl1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SP-lyase Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Sgpl1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Sgpl1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SP-lyase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Sgpl1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SP-lyase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SP-lyase dans les cellules tumorales présentant une expression de Sgpl1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.