SMG5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406989-ACT

SMG5 kodiert eine konservierte Kernkomponente der Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD)-Maschinerie, die die Integrität des Transkriptoms schützt, indem sie die Erkennung und den Abbau aberranter mRNAs fördert. SMG5 bindet an phosphoryliertes UPF1 und arbeitet mit SMG6 und SMG7 zusammen, um über PP2A die Dephosphorylierung von UPF1 und nachgeschaltete Abbauschritte zu koordinieren. Dadurch verknüpft es die mRNA-Überwachung mit der Translations-Termination und der RNA-Qualitätskontrolle. Über NMD beeinflusst SMG5 Genexpressionsprogramme, Stressantworten und die Proteostase, indem es die Anreicherung von Transkripten mit vorzeitigem Stoppcodon sowie bestimmter physiologischer mRNA-Isoformen begrenzt. Eine fehlregulierte NMD wurde in verschiedenen krankheitsrelevanten Kontexten beschrieben, darunter krebsassoziiertes Remodeling des Transkriptoms und genetische Erkrankungen, die durch Nonsense-Varianten verursacht werden, was SMG5 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien in der RNA-Biologie macht.

SMG5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMG5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SMG5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMG5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMG5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SMG5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMG5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SMG5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SMG5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMG5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.