Plásmido CRISPR de Activación (h) SMG5: sc-406989-ACT

SMG5 codifica un componente central conservado de la maquinaria de degradación de ARNm mediada por codones sin sentido (NMD), que protege la integridad del transcriptoma al favorecer el reconocimiento y la eliminación de ARNm aberrantes. SMG5 se asocia con UPF1 fosforilada y colabora con SMG6 y SMG7 para coordinar la desfosforilación de UPF1 a través de PP2A y los pasos posteriores de degradación, conectando la vigilancia con la terminación de la traducción y el control de calidad del ARN. Mediante la NMD, SMG5 influye en programas de expresión génica, respuestas al estrés y proteostasis al limitar la acumulación de transcritos que contienen codones de terminación prematuros y de ciertas isoformas fisiológicas de ARNm. La desregulación de la NMD se ha implicado en diversos contextos relevantes para la enfermedad, incluido el remodelado del transcriptoma asociado al cáncer y trastornos genéticos impulsados por variantes sin sentido, lo que convierte a SMG5 en un nodo útil para estudios mecanísticos de biología del ARN.

SMG5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SMG5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SMG5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SMG5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SMG5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SMG5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SMG5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SMG5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SMG5 en células tumorales con expresión de SMG5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.