Ski Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401509-ACT

Lo SKI umano codifica il proto-oncogene Ski, un coregolatore trascrizionale nucleare che modula programmi di espressione genica deputati al controllo della proliferazione cellulare, della differenziazione e dell’impegno di linea. Ski è noto soprattutto come regolatore negativo della segnalazione TGF-β/SMAD, in cui interagisce con i complessi SMAD2/3/4 e con corepressori per attenuare la trascrizione dei geni responsivi al TGF-β, influenzando così la transizione epitelio-mesenchimale e il rimodellamento della matrice extracellulare. Attraverso il crosstalk con vie quali MAPK e la trascrizione dipendente dall’acido retinoico, SKI contribuisce alla definizione dei pattern di sviluppo e all’omeostasi tissutale. Un’attività di SKI deregolata è stata associata ad alterazioni del controllo della crescita e degli stati di differenziazione in oncologia, mentre perturbazioni germinali di SKI sono correlate a fenotipi del tessuto connettivo e cranio-facciali rilevanti per la ricerca sulle malattie dello sviluppo.

Ski Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SKI senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ski Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SKI nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SKI, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ski. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SKI nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ski nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ski nelle cellule tumorali con espressione di SKI silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.