SIRT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400085-ACT

Humanes SIRT1 kodiert eine NAD+-abhängige Histondeacetylase der Klasse III, die durch Deacetylierung von Histon- und Nicht-Histon-Substraten – darunter p53, FOXO-Faktoren, NF-κB und PGC-1α – die Chromatinzugänglichkeit und Transkriptionsprogramme moduliert. Über diese Zielproteine verknüpft SIRT1 die Nährstoffsensorik mit Stressantworten, mitochondrialer Biogenese, Autophagie und Signalwegen der DNA-Schadensreparatur. Die SIRT1-Aktivität beeinflusst die metabolische Homöostase, Entzündungsprozesse und die zelluläre Seneszenz und verbindet ihre Fehlregulation mit der Biologie kardiometabolischer Erkrankungen, neurodegenerationsassoziierten Mechanismen und tumorrelevanter transkriptioneller Reprogrammierung. Als zentraler epigenetischer und signalvermittelnder Knotenpunkt wird SIRT1 häufig in Modellen für oxidativen Stress, altersassoziierte Phänotypen und Immunaktivierung untersucht.

SIRT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIRT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SIRT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIRT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIRT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SIRT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIRT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SIRT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SIRT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIRT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.