Plásmido CRISPR de Activación (m) SHIP-1: sc-421137-ACT

Inpp5d codifica SHIP-1 (fosfatasa de inositol 5 que contiene el dominio SH2 1), una fosfatasa lipídica enriquecida en células hematopoyéticas que hidroliza el fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) a PI(3,4)P2, atenuando así la señalización dependiente de PI3K. Al contrarrestar la acumulación de PIP3, SHIP-1 modula la actividad aguas abajo de AKT/mTOR e influye en la señalización de receptores inmunitarios, incluidos los receptores Fc, los receptores de citocinas y los receptores de antígeno. En modelos murinos, la actividad de SHIP-1 se asocia con la regulación de los umbrales de activación de células mieloides y linfoides, la señalización inflamatoria y el control homeostático de la supervivencia y la diferenciación de las células inmunitarias. Las vías desreguladas de INPP5D/SHIP-1 son ampliamente relevantes para la investigación sobre disfunción inmunitaria y fenotipos asociados a la inflamación, incluidos contextos en los que la señalización de PI3K está alterada.

SHIP-1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Inpp5d sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SHIP-1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Inpp5d en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Inpp5d, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SHIP-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Inpp5d y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SHIP-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SHIP-1 en células tumorales con expresión de Inpp5d silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.