SHIP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400619-ACT

INPP5D kodiert SHIP-1 (SH2-Domäne-enthaltende Inositol-5-Phosphatase 1), einen in hämatopoetischen Zellen angereicherten negativen Regulator der Phosphoinositid-Signalübertragung, der PI(3,4,5)P3 zu PI(3,4)P2 dephosphoryliert. Durch die Modulation der PIP3-abhängigen Rekrutierung und Aktivierung von AKT und verwandten Effektoren stimmt SHIP-1 die Signalweiterleitung stromabwärts von Immunrezeptoren ab, einschließlich Fc-Rezeptoren, Zytokinrezeptoren und B‑Zell‑Rezeptor-Signalwegen, und beeinflusst dadurch Zellüberleben, Proliferation, Chemotaxis und entzündliche Antworten. Dieser regulatorische Knotenpunkt überschneidet sich mit PI3K–AKT-, MAPK- und angeborenen Immun-Signalnetzwerken, die die Aktivierungszustände myeloider und lymphoider Zellen steuern. Eine Fehlregulation von Aktivität und Expression von INPP5D/SHIP-1 wurde mit aberranter Immun-Signalgebung und entzündungsassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Nutzung in mechanistischen Studien zur Immunhomöostase und zu krankheitsrelevanten Signalnetzwerken unterstützt.

SHIP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen INPP5D-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SHIP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des INPP5D-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der INPP5D-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SHIP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native INPP5D-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SHIP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SHIP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem INPP5D-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.