Plásmido CRISPR de Activación (h) Sec61β: sc-402791-ACT

SEC61B codifica Sec61β, una subunidad pequeña del translocón heterotrimérico Sec61 incrustado en la membrana del retículo endoplásmico (RE), que facilita la importación cotraduccional de proteínas y la integración de proteínas de membrana. Al acoplar el anclaje del ribosoma al RE y coordinarse con la vía de la partícula de reconocimiento de señal (SRP), Sec61β contribuye a la proteostasis secretora y a los procesos de control de calidad del RE vinculados a la respuesta a proteínas mal plegadas y a la degradación asociada al RE. Las alteraciones en el tráfico dependiente del translocón pueden influir en la maduración de receptores, canales y factores secretados, lo que hace que SEC61B sea relevante para estudios sobre estrés del RE, desequilibrio del proteoma y mecanismos más amplios que determinan la homeostasis celular. Dado que el complejo Sec61 también influye en la presentación de antígenos y en la biogénesis de reguladores inmunitarios y metabólicos, SEC61B se examina con frecuencia en cribados de genómica funcional que investigan la adaptación al estrés y fenotipos relacionados con el manejo de proteínas.

Sec61β El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SEC61B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Sec61β El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SEC61B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SEC61B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Sec61β. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SEC61B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Sec61β en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Sec61β en células tumorales con expresión de SEC61B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.