Plásmido CRISPR de Activación (h) SDHA: sc-401689-ACT

SDHA codifica la subunidad A flavoproteica del complejo succinato deshidrogenasa, un componente catalítico central del complejo mitocondrial II que conecta el ciclo del ácido tricarboxílico con la cadena de transporte de electrones al oxidar succinato a fumarato y transferir electrones a la ubiquinona. A través de su papel en la fosforilación oxidativa y la homeostasis redox, SDHA influye en la producción celular de ATP, el metabolismo mitocondrial y el equilibrio de especies reactivas de oxígeno. Las alteraciones en la función de SDHA pueden desorganizar el flujo bioenergético y la señalización de metabolitos, con efectos posteriores sobre la respuesta a la hipoxia y las vías de estrés mitocondrial. Las perturbaciones genéticas y funcionales de SDHA se han asociado con fenotipos de enfermedades mitocondriales y con la biología tumoral con deficiencia de SDH, lo que respalda su utilidad como diana modelo en investigación metabólica y oncológica.

SDHA El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SDHA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SDHA El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SDHA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SDHA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SDHA. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SDHA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SDHA en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SDHA en células tumorales con expresión de SDHA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.