SAF-B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403795-ACT

SAFB (SAF-B, fattore di ancoraggio al “scaffold” B) è una proteina legante DNA e RNA associata alla matrice nucleare che coordina l’organizzazione della cromatina con il controllo trascrizionale e la maturazione del pre‑mRNA. Interagisce con le regioni di ancoraggio allo scaffold/alla matrice e regola programmi di espressione genica collegati all’attività dell’RNA polimerasi II, allo splicing alternativo e alla trascrizione in risposta allo stress. SAF-B è stata implicata nella segnalazione dei recettori ormonali, in particolare nelle reti regolatorie associate al recettore degli estrogeni, e contribuisce al mantenimento della funzione genomica accoppiando l’architettura nucleare al metabolismo dell’RNA. La disregolazione dell’espressione o della funzione di SAFB è stata associata a stati trascrizionali alterati osservati in vie correlate al cancro e in altri disturbi che coinvolgono una regolazione genica aberrante.

SAF-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SAFB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SAF-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SAFB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SAFB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SAF-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SAFB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SAF-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SAF-B nelle cellule tumorali con espressione di SAFB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.