SAC1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404467-ACT

O SACM1L humano codifica a SAC1, uma fosfatase de fosfoinositídeos associada ao retículo endoplasmático e ao Golgi que hidrolisa o fosfatidilinositol-4-fosfato (PI4P) para manter a composição lipídica das organelas. Ao controlar os níveis de PI4P, a SAC1 regula o tráfego de membranas, a integridade do Golgi e a troca de lipídios em sítios de contato entre RE e Golgi, impactando o fluxo da via secretória e a homeostase celular. A sinalização de fosfoinositídeos dependente de SAC1 se conecta a vias mais amplas que governam o brotamento de vesículas, a triagem de cargas e a adaptação ao estresse na rede secretória inicial. A atividade desregulada de SACM1L e o desequilíbrio de PI4P têm sido associados a alterações na dinâmica de membranas e em estados de sinalização relevantes para a biologia de doenças proliferativas e do neurodesenvolvimento.

SAC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SACM1L sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SAC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SACM1L em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SACM1L, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SAC1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SACM1L nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SAC1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SAC1 em células tumorais com expressão de SACM1L silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.