Plásmido CRISPR de Activación (h) Rootletin: sc-401646-ACT

CROCC codifica rootletina, una gran proteína del citoesqueleto rica en estructuras de tipo *coiled-coil* que polimeriza formando las raicillas ciliares y contribuye a la cohesión del centrosoma, el acoplamiento del cuerpo basal y la ciliogénesis. La rootletina actúa como andamiaje de la arquitectura centrosomal y favorece la organización de microtúbulos necesaria para la progresión del ciclo celular y el mantenimiento de la polaridad epitelial. A través de su papel en la formación del cilio primario y la integridad del centrosoma, CROCC es relevante para vías que regulan la señalización dependiente de cilios y la fidelidad mitótica. La desregulación de estos procesos se asocia con fenotipos relacionados con ciliopatías y con defectos más amplios en la homeostasis tisular vinculados a una estructura ciliar anómala o a alteraciones de la función centrosomal.

Rootletin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CROCC sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rootletin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CROCC en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CROCC, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rootletin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CROCC y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rootletin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rootletin en células tumorales con expresión de CROCC silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.