robo2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401916-ACT

ROBO2 codifica il recettore di guida roundabout 2 (robo2), un recettore transmembrana per i ligandi SLIT che regola la guida assonale, la migrazione neuronale e il patterning dei tessuti attraverso la via di segnalazione SLIT–ROBO, conservata evolutivamente. Nelle cellule umane, ROBO2 influenza il rimodellamento del citoscheletro e il movimento cellulare direzionale modulando la segnalazione delle GTPasi della famiglia Rho e le dinamiche di adesione a valle. Oltre al neurosviluppo, l’attività di ROBO2 è stata collegata all’organizzazione epiteliale e alla morfogenesi ramificata, supportando ruoli nell’organogenesi e nel posizionamento cellulare. Un’alterata espressione di ROBO2 o la disregolazione della via sono associate a fenotipi neurosviluppativi e sono state studiate in contesti che coinvolgono programmi aberranti di migrazione e invasione.

robo2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ROBO2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

robo2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ROBO2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ROBO2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di robo2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ROBO2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da robo2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via robo2 nelle cellule tumorali con espressione di ROBO2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.