RIP4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404910-ACT

Das humane RIPK4-Gen kodiert die Rezeptor-interagierende Serin/Threonin-Proteinkinase 4 (RIP4), eine Signalkinase, die nachgeschaltet von der Proteinkinase C wirkt und die Differenzierung von Keratinozyten, die epidermale Morphogenese sowie die Ausbildung der epithelialen Barriere reguliert. RIP4 ist an Signalwegen beteiligt, die die NF-κB- und MAPK-Signalisierung steuern, und steht in Verbindung mit zytoskelettalen sowie Adhäsionsprogrammen, die die epitheliale Architektur prägen. Eine Fehlregulation der RIPK4-Aktivität wurde mit veränderter epithelialer Homöostase, entzündungsassoziierter Signalgebung und Tumorbiologie in Plattenepithelien in Zusammenhang gebracht, wodurch sie für Studien zu Differenzierungszuständen und epithelialen Stressantworten relevant ist. Ihre Vernetzung in Signalwegen unterstützt zudem mechanistische Untersuchungen transkriptioneller Programme, die die Entwicklung des mehrschichtigen Epithels und krankheitsassoziiertes Remodeling steuern.

RIP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RIPK4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RIP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RIPK4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RIPK4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RIP4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RIPK4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RIP4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RIP4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RIPK4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.