RGMc CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406186-ACT

Das humane Gen **HFE2** kodiert das repulsive guidance molecule C (RGMc, auch als Hemojuvelin bekannt), ein glycosylphosphatidylinositol-(GPI)-verankertes Membranprotein, das als Korezeptor in der BMP/SMAD-Signalachse fungiert, welche die Transkription von Hepcidin in der Leber steuert. Durch die Modulation der BMP6-abhängigen Signalübertragung und der nachgeschalteten Phosphorylierung von SMAD1/5/8 integriert RGMc Signale der Eisensensorik, um über die Regulation des ferroportinvermittelten Eisenexports die systemische Eisenhomöostase aufrechtzuerhalten. Eine veränderte HFE2/RGMc-Aktivität ist mit einer dysregulierten Hepcidin-Expression und Eisenüberladung-Phänotypen assoziiert, was RGMc zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Analyse von Netzwerken des Eisenstoffwechsels macht. In zellbasierten Modellen ermöglicht die gezielte Veränderung der RGMc-Spiegel mechanistische Untersuchungen der Dynamik des BMP-Signalwegs, der Hepcidin-Regulationsschaltkreise und eisenbezogener Transkriptionsprogramme.

RGMc Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HFE2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RGMc Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HFE2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HFE2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RGMc-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HFE2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RGMc-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RGMc-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HFE2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.