RBP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401569-ACT

Il gene umano RBP4 codifica la retinol-binding protein 4 (RBP), il principale vettore della vitamina A (retinolo) nel circolo sanguigno e un determinante chiave della distribuzione dei retinoidi ai tessuti periferici. Regolando la disponibilità di retinolo, RBP4 influenza programmi trascrizionali dipendenti dall’acido retinoico che controllano la differenziazione epiteliale, la modulazione immunitaria e il patterning dello sviluppo, e si integra con i processi di secrezione epatica e di metabolismo lipidico. Alterazioni dell’espressione di RBP4 e dell’omeostasi dei retinoidi sono state associate a disfunzioni metaboliche, resistenza all’insulina e fenotipi infiammatori, oltre che ad aspetti della biologia oculare ed epatica, in cui il flusso di vitamina A è strettamente controllato. RBP4 rappresenta quindi un nodo utile per analizzare le vie di trasporto dei retinoidi e le reti di regolazione genica a valle in modelli cellulari umani.

RBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RBP4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RBP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RBP4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RBP4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RBP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RBP4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RBP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RBP nelle cellule tumorali con espressione di RBP4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.