RBKS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404754-ACT

RBKS (Ribokinase) kodiert eine zytosolische Kohlenhydratkinase, die D‑Ribose zu Ribose‑5‑phosphat phosphoryliert und damit die Ribose‑Wiederverwertung mit dem Pentosephosphatweg und der Nukleotidbiosynthese verknüpft. Durch die Regulation intrazellulärer Pools von Ribose‑5‑phosphat beeinflusst RBKS den Purin‑ und Pyrimidinstoffwechsel, die Redoxpufferung über NADPH‑bildende Reaktionen sowie die Proliferationsfähigkeit metabolisch aktiver Zellen. Die RBKS‑Aktivität ist in eine umfassendere Kontrolle des Kohlenstoffflusses eingebunden, die die DNA-/RNA‑Synthese und zelluläre Stressantworten unterstützt. Eine fehlregulierte Riboseverwertung und ein Umbau des Pentosephosphatwegs werden häufig im Kontext des Krebsstoffwechsels, der Aktivierung von Immunzellen und angeborener Störungen untersucht, die die Nukleotidhomöostase beeinträchtigen.

RBKS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RBKS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RBKS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RBKS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RBKS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RBKS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RBKS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RBKS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RBKS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RBKS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.