RAMP3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402235-ACT

Rezeptoraktivitäts-modifizierendes Protein 3 (RAMP3) ist ein membranständiges Accessory-Protein mit einer einzigen Transmembrandomäne, das mit ausgewählten GPCRs der Klasse B, darunter dem Calcitonin-Rezeptor-ähnlichen Rezeptor und dem Calcitonin-Rezeptor, Heterodimere bildet und dadurch Ligandenspezifität, Rezeptor-Trafficking und eine Verzerrung der nachgeschalteten Signalweiterleitung festlegt. Indem RAMP3 Rezeptorkomplexe der Adrenomedullin-/CGRP-Familie formt, beeinflusst es cAMP-abhängige Signalwege und weitere Prozesse wie endotheliale Signalgebung, Barrierefunktion und zelluläre Homöostase, unter anderem durch die Modulation von Rezeptorinternalisierung und -recycling. Eine veränderte RAMP3-Expression wurde mit fehlregulierten GPCR-Signalprogrammen in Verbindung gebracht, die für die kardiovaskuläre Physiologie und tumorgebundene Signalnetzwerke relevant sind, was RAMP3 als Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Rezeptorpharmakologie und zur Regulation von Zellzuständen stützt. Diese Eigenschaften machen humanes RAMP3 zu einem nützlichen Ziel, um die Assemblierung von Rezeptorkomplexen und die Dynamik der Signaltransduktion in physiologisch relevanten Zellmodellen zu untersuchen.

RAMP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAMP3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RAMP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAMP3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAMP3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RAMP3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAMP3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RAMP3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RAMP3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAMP3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.