Plásmido CRISPR de Activación (h) R1: sc-401712-ACT

El RRM1 humano codifica la subunidad catalítica R1 de la ribonucleótido reductasa, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de desoxirribonucleótidos de novo, necesaria para la replicación y la reparación del ADN. R1 se asocia con RRM2 o RRM2B para mantener equilibradas las reservas de dNTP, conectando el metabolismo de nucleótidos con la progresión de la fase S, las respuestas al estrés replicativo y las vías de estabilidad del genoma. La actividad desregulada de RRM1 puede modificar la tolerancia al daño del ADN y la carga mutacional, lo que la hace relevante para estudios de señalización proliferativa, firmas de respuesta quimiogenómica y mecanismos de mantenimiento del genoma en cáncer y otros trastornos caracterizados por estrés replicativo.

R1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RRM1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

R1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RRM1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RRM1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de R1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RRM1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de R1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía R1 en células tumorales con expresión de RRM1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.