Plásmido CRISPR de Activación (h) PTG: sc-404419-ACT

PPP1R3C codifica la proteína dirigida al glucógeno (PTG), una subunidad reguladora que recluta la fosfatasa de proteínas 1 hacia las partículas de glucógeno y coordina la desfosforilación de enzimas clave que controlan la síntesis y la degradación del glucógeno. Al actuar como andamiaje y situar la actividad fosfatasa cerca de complejos metabólicos del glucógeno, PTG ayuda a ajustar el almacenamiento celular de glucosa, la homeostasis energética y la comunicación cruzada de señales con vías sensibles a los nutrientes. La alteración de la expresión de PPP1R3C o de la función de PTG se ha asociado con una acumulación de glucógeno desregulada y con fenotipos metabólicos relevantes en tejidos sensibles a la insulina. En consecuencia, PPP1R3C se estudia ampliamente en modelos de manejo de la glucosa, adaptación al estrés y regulación metabólica específica de tejidos.

PTG El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PPP1R3C sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PTG El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PPP1R3C en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PPP1R3C, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PTG. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PPP1R3C y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PTG en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PTG en células tumorales con expresión de PPP1R3C silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.