Plasmide CRISPR d'Activation (h) PORCN: sc-413044-ACT

Le gène humain **PORCN** code une **O-acyltransférase** membranaire du réticulum endoplasmique qui catalyse la **palmitoléoylation** des ligands **WNT**, une modification indispensable à la sécrétion des WNT, à l’établissement de gradients extracellulaires et à l’interaction avec leurs récepteurs. Par cette étape de maturation essentielle, PORCN régule les voies de signalisation WNT **canonique** et **non canonique**, influençant la transcription dépendante de la **β-caténine**, la spécification du destin cellulaire, la prolifération et la mise en place des tissus. Une altération de la production de signal WNT dépendante de PORCN est impliquée dans des anomalies du développement et des maladies caractérisées par une activité dérégulée de la voie WNT, ce qui étaye son utilisation dans des études mécanistiques des programmes de différenciation et du remaniement des réseaux de signalisation. La fonction de PORCN est également pertinente pour l’étude de l’homéostasie épithéliale, de la biologie des cellules souches et des interactions entre voies de signalisation influençant la morphogenèse et des états de signalisation oncogéniques.

PORCN Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PORCN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PORCN Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PORCN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PORCN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PORCN. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PORCN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PORCN au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PORCN dans les cellules tumorales présentant une expression de PORCN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.